Описание
Синонимы (rus): Антинуклеарные антитела, специфичные АНА, антитела к экстрагируемым ядерным антигенам, антитела к экстрагируемым нуклеарным антигенам, анти-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, dsDNA, CENT-B, Jo-1, к гистонам, к нуклеосомам, Ribo P, AMA-M2
Синонимы (eng): ANA, ANA profile, antinuclear antibodies comprehensive profile, ANA-specific antibodies, anti-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, dsDNA, CENT-B, Jo-1, histone, nucleosome, Ribo P, AMA-M2
Биоматериал: Венозная кровь
Показатель(и): Антитела к антигенам: Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа/52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENT-B, Jo-1, dsDNA/гистоны/, нуклеосомы, Ribo P, AMA-M2
Метод(и): Иммуноблот
Тип контейнера и особенности преаналитики: Биохимическая пробирка с активатором свертывания,6 мл (красная или коричневая крышечка)
Антинуклеарные антитела являются характерным маркером для диффузных заболеваний соединительной ткани, аутоиммунных заболеваний печени и некоторых других болезней. Это семейство антител, связывающее рибонуклеиновые кислоты, а также белки, с ними взаимодействующие. На данный момент известно около 200 аутоантител этого семейства, однако в клинической лабораторной диагностике оправдано определение лишь наиболее распространенных из них. Благодаря иммуноблоту антинуклеарных антител есть возможность одновременного исследования 15 антител данного семейства. Поскольку каждое антитело характерно для какого-либо одного или нескольких заболеваний, возникает возможность дифференциальной диагностики внутри группы аутоиммунных болезней. Кроме того, определённые антитела могут отвечать за развитие определенной клинической картины внутри единой нозологической единицы. Таким образом, обнаружение специфического антитела является предиктором развития определенной клинической картины у пациента. Условно можно сказать, что иммуноблот антинуклеарных антител является тестом второго уровня, и целесообразность его использования возникает при обнаружении антинуклеарных антител посредством проведения тестов на выявление антинуклеарного фактора и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА). Если данные тесты обеспечивают высокую чувствительность для выявления антинуклеарных антител, то иммуноблот характеризуется высокой специфичностью для отдельных аутоиммунных заболеваний. Следует заметить, что на данный момент обнаружены не все типы антинуклеарных антител и, кроме того, не все известные типы используются в лабораторной диагностике. Таким образом, результат иммуноблота может быть отрицательным, и это не обязательно исключает диагноз аутоиммунный патологии.
Общая характеристика
Боррелиоз или болезнь Лайма (по названию города, где в 1975 г. было выявлено) – распространённая инфекция, основным хозяином и переносчиком которой являются иксодовые клещи. Возбудитель – спирохета Borrelia burgdorferi, единственная патогенная для человека. Хозяевами являются многие позвоночные животные: собаки, овцы, птицы, коровы и лошади. Заболевание характеризуется поражением сердца и неврологической «триадой»: асептический менингит, паралич лицевого нерва и периферические невропатии. Через 6 недель, а иногда через несколько лет, у нелеченных больных развиваются тяжёлые поражения суставов. Все известные геновиды В. образуют комплекс B.burgdorferi sensu lato, представители которого неравномерно распределены в пределах нозоареала ХЛ. Патогенность для человека доказана для B.burgdorferi sensu stricto, B.afzelii и B.garinii. Антитела класса IgG к Borrelia burgdorferi могут выявляться на 1 — 3 неделе после инфицирования, вслед за антителами класса IgM, пик IgG — через 1,5 — 3 месяца. Антитела к Borrelia burgdorferi часто не выявляются на ранней стадии заболевания или при рано назначенной антимикробной терапии. Отрицательный результат серологических тестов на ранних стадиях инфекции не является подтверждением её отсутствия и требует перепроверки в динамике через 2 — 4 недели. Антитела класса IgG циркулируют в крови длительный срок (от нескольких месяцев до нескольких лет), даже после успешной антимикробной терапии и излечения инфекции. Иммунитет против Borrelia burgdorferi не является стерильным. Специфичность ИФА тестирования антител к Borrelia burgdorferi в настоящее время достигает 95%, т. к. неспецифические реакции, перекрёстное реагирование с антигенами других бактерий могут примерно в 5% случаев давать ложноположительные результаты. В сомнительных случаях для подтверждения результатов ИФА-тестов используют иммуноблот. Скрининговый метод позволяющий определить группу риска по данному заболеванию, особенно в эндемичном районе. Через 4 недели после начала заболевания назначают исследование на наличие IgM, если прошло более 4х недель пациента исследуют на наличие Ig G, при получении сомнительных или положительных результатов пациенты должны быть повторно тестированы методом иммуноблот.
Интерпретация
Тест является полуколичественным, что означает, что результат для каждого антигена представляется в «крестах», которые отражают концентрацию и аффинность антитела. Антитела к антигену Sm (Smith) являются высоко специфичными для системной красной волчанки. Анти-Sm направлены против 7 белков (B/B’, D1, D2, D3, E, F, G), составляющих ядро малого ядерного рибонуклеопротеина, и их определение входит в критерии СКВ с 1997 года. Антитела к SS-A (Ro52), интерферон-индуцируемому протеину, являются непецифичными и обнаруживаются при многих аутоиммунных заболеваниях. Так, антитела к данному антигену могут быть обнаружены при системной красной волчанке, её кожных формах, ревматоидном артрите, аутоиммунных заболеваниях печени, болезни Шегрена и так далее. Антитела к SS-A (Ro60) являются значительно более специфичными и отмечаются при классической системной красной волчанке, изолированно при кожной форме системной красной волчанке, а также являются основным показателем болезнь Шегрена. При обнаружении данного антитела у беременной, страдающей волчанкой, риск врожденной красной волчанки у её ребенка значительно повышается. Антитела к SS-B наиболее характерны для синдрома Шегрена (в этом случае типично обнаружение совместно с SS-A), а также для системной красной волчанки. PCNA-антитела обнаруживаются при системной красной волчанки с повышенным риском волчаночного нефрита. Антитела к рибосомам (Ribo P) обнаруживаются при системной красной волчанки в случае повышенного риска вовлечения центральной нервной системы. Антител к нуклеосомам наиболее значительно коррелирует с системной красной волчанкой с картиной волчаночного гломерулонефрита. Антитела к двуспиральной ДНК является маркером системной красной волчанки, внесённым в критерии ее диагностики с 1997 года. Антитела к snRNP/Sm являются неспецифическими и могут свидетельствовать как о смешанном заболевании соединительной ткани, так и о склеродермии или системной красной волчанке с низким риском почечного вовлечения. Антитела к гистонам характерны для лекарственной волчанки, склеродермии. Повышение титра антител к Scl-70 свидетельствует о системном склерозе с диффузным поражением кожи и внутренних органов. Выработка антител к PM-Scl достаточно специфично свидетельствует в пользу склеродермии, сопровождающейся полимиозитом. Обнаружение антител к антигену CENT-B свидетельствует о развитии CREST-синдрома, сопровождающегося склеродактилией, телеангиоэктазией, подкожными кальцинатами, синдромом Рейно и эзофагитом. Синтез антител к Jo-1 характерен для полимиозита в виде антисинтетазного синдрома. Антитела к AMA-M2 могут встречаться при первичном билиарном циррозе или синдроме Шегрена.
Расшифровка результатов анализа (для специалистов!*)
Уремия может приводить к ложноотрицательному результату. Повышают референсные значения: прокаинамид, дизопирамид, пропафенон, некоторые ингибиторы АПФ, бета-блокаторы, гидралазин, пропилтиоурацил, хлорпромазин, литий, карбамазепин, фенитоин, изониазид, миноциклин, гидрохлортиазид, ловастатин, симвастатин.
Интерпретация результатов:
Повышение референсных значений: системная красная волчанка; аутоиммунный панкреатит; аутоиммунные заболевания щитовидной железы; злокачественные новообразования печени и легких; полимиозит/дерматомиозит; аутоиммунный гепатит; смешанное заболевание соединительной ткани; миастения; диффузный интерстициальный фиброз; синдром Рейно; ревматоидный артрит; системная склеродермия; синдром Шегрена.
Понижение референсных значений: Отсутствие системного заболевания соединительной ткани.
Для интерпретации результатов исследования – обращайтесь к своему лечащему врачу!
Референсные значения (норма)
* Расшифровка результатов предназначена для вашего лечащего врача, который определит точный диагноз и назначит схему лечения, учитывая результаты не только данного анализа, но и всего комплекса исследований для вашего конкретного случая. Не ставьте сами себе диагноз — обязательно обратитесь к врачу!
Что такое иммуноблот на ВИЧ
Иммуноблот на ВИЧ имеет международное название western blot. Данная методика лабораторной диагностики выявляет антитела к ВИЧ в сыворотке крови. Протоколы Всемирной организации здравоохранения предписывают использовать его в качестве дополнительной экспертизы в случае, когда ИФА показывает наличие антител. Порядок именно таков, поскольку данный анализ является более точным, специфическим и дорогостоящим.
ВИЧ иммуноблоттинг разработали в американской лаборатории George Stark, которая располагается в Стэнфордском исследовательском университете. Помимо непосредственно медицины, методика применяется в генетике, биохимии, молекулярной биологии и является особо точной.
Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.
Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.
После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.
1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).
Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.
Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.
Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.
Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.
Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.
Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.
Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.
Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А — с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б — первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.
Протокол:
I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков
Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).
Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.
После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.
Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.
II. Электроперенос
Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.
Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте.
Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.
Что такое вестерн-блоттинг?
Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.
В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.
Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
После проведения ДСН — электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.
Может ли иммуноблот быть ошибочным?
Может ли иммуноблот быть ошибочным — интересуются все, кому после проведения лабораторных исследований поставили диагноз ВИЧ? Это высокоточный анализ и если он показывает наличие инфекции, то этого достаточно для подтверждения диагноза. В ином случае, результат будет отрицательным или неподтверждённым.
Бывают ситуации, когда полоски указывающие на вирус слишком бледные и понять их довольно сложно. Такой результат стоит поддать сомнению и пройти исследование в другой клинике. В целом, ответ на вопрос может ли иммуноблоттинг быть ошибочным — однозначно нет. Данное исследование служит для подтверждения ИФА и если результат обоих идентичен, то заболевание подтверждается. В случае, когда ИФА положительный, а вестерн блот отрицательный — ВИЧ у человека нет.
Иммуноблоттинг принцип метода
Иммуноблоттинг (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА.
Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке.
При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом.
При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).
Радиоиммунный анализ (РИА)
В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.
РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.
Контрольные вопросы
Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии?
Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему?
Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать?
Как титруют комплемент?
Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК?
Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК?
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат?
Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит?
Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции.
Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.
